摘要：为探究浙江省舟山市某养殖池塘中三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)暴发疾病的病因,应用组织病理学、分子生物学和荧光原位杂交等技术手段,对患病三疣梭子蟹组织进行检验。研究发现,患病三疣梭子蟹的临床症状主要表现为食欲下降,行动迟缓,鳃水肿;光学显微镜下观察鳃及血淋巴液未发现寄生虫,肝胰腺等组织中也未分离到致病菌;采用PCR方法对病蟹进行血卵涡鞭虫(hematodinium)、白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)、青蟹双顺反子病毒(mud crab discistrovirus-1,MCDV-1)以及青蟹呼肠孤病毒(Scylla serrata reovirus,SSRV)蟹类常见病原PCR检测,结果均为阴性;病蟹的肝胰腺、心脏、鳃等组织的病理切片中可观察到明显的细胞病变和嗜酸性包涵体;超薄切片电镜观察显示:病蟹的肝胰腺、心脏和鳃组织中均存在六边形病毒颗粒,粒子直径150nm左右,与已报道的十足目虹彩病毒1 (decapoda iridescent virus 1,DIV1)形态特征相似。采用特异性套式PCR检测方法对患病蟹组织样品进行DIV1病原检测,所有样本均扩增出457 bp和129 bp大小的目的片段。进一步根据Gen Bank中DIV1的主要衣壳蛋白(major capsid protein,MCP)表达基因和三磷酸腺苷酶(ATPase)表达基因序列设计特异性引物,均能从病蟹样品中扩增出预期大小的MCP和ATPase基因开放阅读框(open reading frame,ORF)区全长。将扩增获得的MCP和ATPase基因ORF区全长进行测序和同源序列比对分析,进化树分析结果表明其与十足目虹彩病毒属(Decapodiridovirus)病毒的MCP和ATPase基因序列自然聚为一支,判定导致此次三疣梭子蟹发病病原为DIV1。根据原位杂交探针设计原则,以DIV1的MCP和ATPase基因的保守区域为靶位点分别设计探针,通过荧光原位杂交获得了病毒粒子在病蟹肝胰腺、心脏、肌肉和鳃组织的分布情况,与电镜切片观察和套式PCR检测结果相符。研究结果可为海水养殖三疣梭子蟹十足目虹彩病毒1病诊断与防控提供参考。
