三疣梭子蟹 (Portunust tuberculatus) 乳化病的组织病理和超微病理研究
王国良 金 珊 李 政 陈寅儿
提要 利用组织切片及超薄切片电镜技术对患“乳化病”三疣梭子蟹的鳃、肝胰腺、步足肌肉、心肌和性腺 5 种组织进行病理学分析。组织病理显示：乳化病的病变性质为变质性炎症，主要病变部位在肝胰腺，其病灶表现为水变性、脂肪变性和细胞坏死等症状，步足肌和心肌表现出肌纤维断裂、浑浊等症状。超微病理显示：在肝胰腺和步足肌组织中有大量细菌，肝胰腺细胞结构损伤主要表现为微绒毛损伤脱落、线粒体坏死、溶酶体增多及脂肪滴变性，肌纤维断裂、溶解，血隙中血淋巴细胞受严重侵染。
关键词 三疣梭子蟹，肌肉乳化病，组织病理，超微病理
中图分类号 S945
三疣梭子蟹 (Portunus trituberculatus) 隶属于甲壳纲 (Crustacea) 、十足目 (Decapoda) 、梭子蟹科 (Portunidae) ，是一种大型海产经济蟹类，三疣梭子蟹肉味鲜美，营养丰富，是人们极为喜爱的，水产品，同时也是重要的出口创汇品种，已逐渐成为我国海水养殖的主导品种之一 ( 薛俊增等， 1997 ， 1998) 。近年来，随着梭子蟹养殖规模的不断扩大，各种病害也开始接踵而至，并呈现出大 规模发生和暴发性流行的趋势。“乳化病”是近年来危害江浙沿海梭子蟹养殖最为严重的一种疾病，该病以肌肉和肝胰腺组织严重乳化为主要症状。 2002 — 2003 年间浙江宁波、舟山部分病发密集地区，发病情况相当严重，造成大批养殖成蟹死亡，经济损失严重。目前已有学者对该病的 流行病学、病原及预防进行了研究 ( 吴友吕等， 1998 ；金珊等， 2003 ；许文军等， 2003) ，为进一步分析该病的病理变化以及致病机理，作者于 2003 年 10 月一 2004 年 6 月期间从养殖梭子蟹发病区采集大量典型病蟹样品，对病蟹组织进行病理学研究，以期为该病的病理研究和防治工作提供理论依据。
讨论
1. 病原体观察 在病蟹肝胰腺细胞及血淋巴细胞中发现有大量杆状细菌存在，与作者对该病病原菌研究的结果相应，应为溶藻弧菌 (V.alginolyticus) 。溶藻弧菌是海水中的一种常见的条件致病菌，可引起 平鲷、大黄鱼和石斑鱼等海水养殖鱼类疾病，同时也是贝类、对虾和蟹类养殖中常见的致病菌，因此已成为近海养殖海洋生物致病的主要病原体之一 ( 林克冰等， 1999 ；金珊等， 2003 ；吴友吕等， 1998) 。电镜观察未发现有病毒及其它病原体存在，然而在病蟹乳化腔液涂片中观察到的大量葡萄牙假丝酵母 ( 图 1d) ，却在病蟹各组织中未能检察到。这与作者在同一养殖塘进行病蟹解剖、病原分离中，均能分离到溶藻弧菌，但酵母菌只在具有显著乳化病症的病蟹中才能分离到的结果相一致。说明酵母菌为继发性感染，而典型的乳化病症主要是由这种继发感染引起。
2. 病理变化特征 在病理观察中发现病变组织的共同特征为不同程度的水变性和脂肪变性。其中损伤最为严重的组织为肝胰腺，其侵染的主要部位是肝胰腺组织中的上皮细胞，与陶保华等在斑节对虾弧菌病研究中的现象类似 ( 陶保华等， 2001) 。受病原菌感染的肝细胞结构崩解，影响肝胰腺正常消 化、合成、储存及解毒等正常功能，致使细胞内含物含量大幅度波动，如肝脂肪滴大量蓄积，从而 严重破坏胞器的正常结构组成以及各自的生理 机能 ( 方 敏等， 2003 ；陆宏达等， 1999) 。因此， 肝胰腺应是病原菌侵染的主要靶器官。步足肌和心肌的病变次之，表现出肌纤维断裂、浑浊等症状，严重时呈乳化状，肌细胞正常细胞结构被破坏，使其呼吸、运动及摄食等功能无法正常发挥，同时炎症过程中，肌肉组织的耗氧量增加，氧化过程增强，导致各种氧化不全产物的堆积量远远大于正常状态下血淋巴缓冲系统所能中和的量，容易致使酸中毒 (Sinnhuber et al,1968 ；黄琪炎， 1993) ，从而加重肌肉组织细胞的变性作用。血淋巴细胞的病变以细胞的集聚和破裂为主要特征。和虾类动物一样，梭子蟹血淋巴细胞同样具有免疫防御能力。在感染初期不同组织的病灶中，往往可以观察到特化的血淋巴细胞的集聚现象，这种集聚反应类似脊椎动物中的炎性细胞浸润过程，是血淋巴直接参与免疫防御过程的体现 (Newmen et al ， 2001 ； Ekpanithanpong et al ， 1999) 。 梭子蟹血淋巴细胞在进行免疫防御作用的同时，自身也因受溶藻弧菌的侵染而产生严重损伤，致 使其正常结构改变及机能障碍，如解剖病理研究中观察到的血色改变、凝固时间延长或不再凝固 的现象，可能与梭子蟹中血蓝蛋白等组分受细菌毒素损伤有关 (Yoo et al ， 1989) 。
3 ． 病机理分析 根据组织病理学和超微结构病理学的观察与研究结果，作者认为乳化病的发病机理可能是：在养殖生产中，不良的生态环境和不完善的养殖技术容易导致梭子蟹群体免疫力下降，易受病原菌的入侵。入侵病原菌侵染血淋巴细胞，并随开放式血液循环系统进入各组织，进一步感染体内其它组织或器官，促使对病原体易感性强的组织 ( 如肝胰腺组织 ) 开始发生病变。对肝细胞内不同患病时期及不同胞器受损情况进行分析，作者认为，肝细胞外缘的微绒毛可能是溶藻弧菌侵染肝细胞的初始发生基质，这与组织病理观察中膜性结构最早受损伤的结果相应。而微绒毛的损伤是导致肝胰腺上皮 细胞处于开放状态的主要原因，溶藻弧菌由经血淋巴携带进入胞内并大量增殖。肝胰腺上皮细胞内 大量溶藻弧菌增殖，胞外毒素大量积聚，引起肝细胞内各胞器不同程度病变，同时大量增生的初级溶 酶体和次级溶酶体内含有的多种消化酶则反过来会破坏肝细胞的其它正常胞器结构，诱发变质性炎症。在研究中还发现，当乳化病病变发展至末期， 肌肉及肝胰腺严重乳化时，往往伴随酵母菌的继发性感染，这种酵母菌的大量增殖是导致病变由水变性转向脂肪变性的重要外因。大量葡萄牙假丝酵母产生的胞外蛋白酶会破坏蟹体内病灶 区域蛋白，使发生伤口不易愈合及病变更加严重，直至死亡。有学者在罗氏沼虾亲虾暴发性疾 病的研究中也观察到有肝胰腺发白糜烂等相似病症，并鉴定该病病原属于酵母菌 ( 孙玉华等， 1998) 。另外还有学者研究了罗氏沼虾莫格球拟酵母菌的组织病理，发现被莫格球拟酵母菌侵袭 的组织出现以坏死为主的变质性病变 ( 蔡完其， 1996) 。这些病变与作者在病蟹患病后期观察的结果很相似。 溶藻弧菌和葡萄牙假丝酵母在乳化病组织病理学研究中，呈现出显著的延续性和稳定性，并通过人丁感染实验得到证实，使得传统的用以确定未知感染性疾病病原的 koch 原则，不太适 用于梭子蟹乳化病的病原诊断和病理学分析。从实验结果来看，梭子蟹乳化病的发生与两种 病原的致病机制及其相互作用有关。弧菌首先通过胞外毒素的作用破坏蟹体防御体系，为酵 母菌的侵染创造条件，酵母菌在侵染蟹体的同 时，还具有迅速侵占宿主营养成分的作用，而缺乏营养会使得蟹体对弧菌的易感性增高。这两种病原之间的相互协同作用，可能是乳化病能在短时间内迅速爆发造成大面积死亡的重要原 因之一。
4. 防治建议 由于三疣梭子蟹乳化病的致病机理复杂，且表现出细菌与酵母菌并发感染的特点，生产上很难直接应用针对性药物来防治。因此，在养殖生产上应从改善养殖生态环境、控制养殖密度和加 强水质管理等综合防治环节人手。建议养殖前 彻底清塘，根据池塘条件放养适宜密度，控制投饲的数量和质量，适时增氧，保持良好的养殖水体环境；使用无公害药物定期或不定期地进行水体消毒，也可使用微生态制剂来改善和稳定池塘底质环境。提倡采用积极主动的防病措施，不主张发病后的被动性治疗，这也是梭子蟹健康养殖 的基本原则。