贝类血细胞及其免疫功能研究进展
孙敬锋， 吴信忠
THE PROGRESS OF STUDIES ON MOLlUSCAN HEMOCYTE AND ITS IMMUNOLOGICAL FUNCTION SUN Jing—Feng and WU Xin-Zhong
（ 1 ． South China Sea Institute of Oceanology ， ChineseAcademy of Sciences ， Guangzhou 510301 ；
2 ． College of Animal Sciences ， Zhejiang Univensity ， Hangzhou 310029 ；
3 ． College of Life Science ， South China Normal University ， Guangzhou 510631)
关键词：贝类；血细胞；免疫功能
Key words ： Mollusk ； Hemocyte ； Immunological function
图分类号： S944 文献标识码： A 文章编号 :1000-3207(2006)05-0601-07
贝类由于是开放性系统，不存在特异性体液免疫，贝类 的宿主免疫防御包括以血细胞为基础的细胞和体液系统。 血细胞能够在体内或体外吞噬各种有机和无机颗粒，清除病 原生物和自身损伤或死亡细胞，而且血细胞能够产生各种非 特异性体液因子来参与宿主的免疫防御过程。所以贝类的 血细胞在宿主免疫防御机制中起着重要作用。近年来，随着 贝类养殖规模的扩大，贝类病害日益严重，给中国的贝类养 殖业造成了重大经济损失。所以研究贝类免疫学，特别 足贝类血细胞的免疫防御功能和机制，以解决贝类养殖中发 生的病害问题已成为研究的热点。本文依据国内外有关文 献，就贝类血细胞的分类、结构及免疫功能方面的研究作综述，为国内外研究提供理论基础及资料。
• 贝类血细胞结构、分类
贝类血细胞的分类一直分歧很大，有人将其分为三类： 无颗粒细胞、小颗粒细胞、大颗粒细胞，也有人将其分为四 类：大颗粒细胞、小颗粒细胞、透明细胞、浆细胞，还有人将其 分为八类，甚至几十类，至今无统一命名。关于血细胞的 分类， Moore 等根据血细胞超微结构和对染色反应的不同， 将紫贻贝 (Mytilus galloprovincialis) 血细胞分为两大类，无颗粒 的嗜碱性细胞和有颗粒的嗜酸性颗粒细胞，嗜碱性细胞可进 一步分为小淋巴细胞和大的吞噬性巨噬细胞。他们认为巨 噬细胞是主要参与清除外来异物的细胞类型，而小淋巴细胞 可能是嗜碱性细胞系的干细胞，因为在小淋巴细胞中发现有 丝分裂现象。 Bubel 等和 Bayne 等分别在紫贻贝 (Mytilus galloprovincialis) 和加洲贻贝 (Mytilus californianus) 中也发现了 3 种血细胞，嗜酸性颗粒细胞、小嗜碱性透明细胞、大嗜碱性透 明细胞，其中嗜碱性细胞包含有溶酶体酶，能吞噬胶体碳颗 粒；而颗粒细胞体积较小，在血淋巴中占优势，是防御反应中 最早出现的细胞类型，无吞噬能力。 Ruddell 将长牡蛎 (Cras — sostreagtgas) 血细胞分为 3 种类型，无颗粒的阿米巴状细胞、 嗜碱性颗粒细胞和嗜酸性颗粒细胞。 Cheng 等将美国东部 牡蛎 (Crassostrea virginica) 和硬壳蛤 (Mercenaria mercenaria) 的 血细胞分为 3 类，颗粒细胞、透明细胞、纤维细胞。 Woolton 等利用光镜和电镜研究浅溝蛤 (Scrobicularia pluna) 的血细 胞，也鉴定了 3 种类型：嗜酸性颗粒细胞，嗜碱性颗粒细胞、 嗜碱性无颗粒细胞。嗜酸性颗粒细胞含有大量的颗粒和较 多的空泡；嗜碱性颗粒细胞含有较小的颗粒和大量的糖原颗 粒，嗜碱性无颗粒细胞较小，核大。在国内也有部分研究者 对贝类血细胞分类进行了研究：李太武等的研究结果表明， 皱纹盘鲍 (Haliotis discus hanai) 血淋巴中的细胞可分为颗粒细 胞和透明细胞两大类，颗粒细胞又可细分为颗粒多和颗粒少 两种类型，颗粒细胞具有吞噬能力而透明细胞无吞噬能力。 孙虎山等对栉孔扇贝 (Chlamy ferreri) 血细胞进行分类，将其 分为拟淋巴细胞、血栓细胞、中性粒细胞、嗜碱性粒细胞、嗜 酸性粒细胞和巨嗜细胞六类，并认为中性粒细胞和巨嗜细胞 为主要的吞噬细胞。张维翥等分别对海湾扇贝和栉孔扇 贝的血细胞分类进行了研究，根据血细胞的大小、形态结构 可将海湾扇贝血细胞分为四种类型：小透明细胞、大透明细 胞、小颗粒细胞和大颗粒细胞；栉孔扇贝血细胞可分为五种 类型，小透明细胞、大透明细胞、小颗粒细胞、中性粒细胞和 大颗粒细胞。实际上，上述分类就是将海湾扇贝和栉孔扇贝 血细胞分为透明细胞和颗粒细胞两大类，两类细胞再根据大 小进一步细分。
基于以上研究发现，学者们主要依据血细胞中颗粒的有 无及对染色的反应，运用光学显微镜和电子显微镜对贝类血 细胞进行分类。随着研究的深入，近年来不少研究者运用新 技术，新方法对贝类血细胞的分类进行研究，如密度梯度离 心、单克隆抗体、植物凝集素、免疫磁力分离、酶细胞化学、流 式细胞技术等方法。 Ford 应用 Couter 计数器和流式细胞计 数器，测量的结果将牡蛎血细胞分为二种颗粒细胞和一种无 颗粒细胞三个亚群。 Russell-Pinto 利用光镜、电镜及酶细胞化 学法对双壳贝类 Cerastoderma edule 进行研究，根据其对绵羊 红血球反应不同，将血细胞分为 3 个类型：大的吞噬型细胞、 球形凝集细胞和圆形颗粒细胞。 Noel 等应用单克隆抗体技 术，对贻贝血细胞的业群从其抗原性特征进行了研究，免疫 染色鉴定了 4 种单抗，从免疫染色的结果来看，贻贝至少可 以区分出 3 种不同类型的血细胞。 Nakayama 等通过形态观 察和细胞化学研究，认为在番红砗磲 (Tridacna crocea) 存在 3 类血细胞，命名为嗜酸性颗粒细胞、无颗粒细胞和桑葚样细 胞，并发现 3 类细胞在吞噬作用和血细胞凝集等过程中表现 不同的功能。 Lopez 等发现针对长牡蛎血细胞的抗体对蛤仔 (Ruditapes decussatus) 所有血细胞均有交叉反应，然而针对紫 贻贝血细胞的抗体却没有表现出交义反应，因此认为单克隆 抗体并不能区分血细胞亚功能群。 Carballal 等发现紫贻贝的 血细胞在功能上有差异，颗粒细胞吞噬能力很强，而透明细 胞则不具备吞噬能力，而且嗜酸性颗粒细胞的吞噬能力比嗜 碱性颗粒细胞强。 Hine 等认为在贝类血淋巴中颗粒细胞是 一个独立的类群，而尤颗粒细胞在表型和超微结构上是不相 同的，可分为 3 种细胞，胚样 (Blast-like) 细胞、嗜碱性巨噬样 细胞、透明细胞；颗粒细胞和巨噬样细胞的功能不同，血淋巴 的组成在个体间变化很大，而且颗粒细胞在早期和发育过程 中可能是透明的。胚样细胞的区分表明造血过程可以发生 在周围相连的厂‘泛组织中，产生血细胞的方式与脊椎动物相 似。 Xue 等采用流式细胞仪测定欧洲扁牡蛎 Dstrea edul~ 血 细胞亚群，结果显示血细胞可能由 3 个血细胞亚群组成，这 三个亚群分别对应于光镜和电镜分析鉴定的三个亚群，小透 明细胞、大透明细胞、颗粒细胞。 Soares-da-Silva 等利用流式 细胞仪技术和形态学观察将淡水蛏 (Anodonta cygnea) 的血细 胞分为两大类，一类较大，有颗粒，占血细胞总数的 75 ％，另 一类较小，无颗粒，约占血细胞总数的 25 ％。
由于贝类种间的差异性和研究方法的不同，造成了贝类 血细胞分类上的复杂化，难以获得统一的标准。但血细胞一 个重要的特征是细胞质内颗粒的有无，因此，目前比较认同 的标准是将贝类血细胞分为颗粒细胞和透明细胞两大类。 但 Nakayama 等所报道的桑葚样细胞不同于颗粒细胞和透明 细胞，可能是一种新的细胞类型。这种情况可能是由于在有 的贝类中确实存在不止两类血细胞，但也有可能是用形态学 手段不能区分的同一细胞系的不同发育阶段和形式，因此采 用多种手段和方法对贝类血细胞进行分类是必要的。
2 血细胞免疫功能
2.1 吞噬作用
贝类的主要防御手段是由血细胞完成的吞噬作用 (Phagocytosis) 。吞噬作用能够清除入侵的病原体包括细菌、 原虫、大分子物质及无机颗粒等。当外界条件改变，尤其是 动物受到外界抗原物质刺激时，贝类的主要表现就是吞噬反 应，而且其血细胞吞噬外来异物时，清除的速率大小取决于 细胞表面的特征。在大多数报道的贝类中，吞噬作用主要是 由颗粒细胞完成的，颗粒细胞表现出很高的吞噬能力，而且 其吞噬能力与年龄无关，但易受外界环境因素的影响，如温 度、盐度等，透明细胞也具有一定的吞噬能力，但不是主要 的。从免疫防御的角度讲，血细胞可以活跃地趋化到炎症和 损伤部位，进行吞噬，是免疫防御的主要细胞类型。
2 ． 1 ． 1 吞噬和杀伤机制 吞噬作用的过程大致可以分为趋 化、黏附、内吞以及杀伤消化四个阶段。研究证明贝类血细 胞可以向外源颗粒趋化靠近，贝类具有开放式循环系统，器 官浸浴在血淋巴中，血管也没有完整的内皮系统，血细胞可 以较自由地到达广泛的器官和组织。与外来物质的接触较 为充分，因此，趋化的选择意义不像在高等动物那样重要。 血细胞靠近异物后首先发生黏附，随后，血细胞伸出伪足对 异物进行包裹，伪足相接触后细胞质膜融合，形成吞噬小体 进入细胞。 Cajaraville 和 Pal 对贻贝 (Mytilus edulis) 亚显微结 构的电镜研究表明，颗粒细胞和透明细胞都可以由局部细胞 质膜内陷形成衣被小泡或无衣被的电子透明的内吞小体，完 成内吞。 LeGall 等还证明内吞过程有细胞骨架的活跃参与。
血细胞对吞噬后的病原体的杀伤作用主要通过两条途 径实现，一是将外源颗粒内化后形成吞噬小体，然后吞噬小 体与含有水解酶类的胞质颗粒融合，逐步将外源颗粒水解消 化，颗粒细胞中的水解酶包括溶菌酶、磷酸酶、脂酶、蛋白酶、 葡萄糖苷酶等。 Mohandas 等用扫描电镜的方法证明，在 受到细菌刺激时，硬壳蛤的颗粒细胞在吞噬外来细菌的过程 中，将溶菌酶释放到血清中，可见血细胞不仅直接参与吞噬 反应，还释放水解酶类到血淋巴中参与体液免疫。 Cushing 等用一种革兰氏阴性菌 EMD — l 作诱导源，对红鲍、粉红 鲍、黑鲍进行注射诱导研究他们的免疫反应，其结果表明，在体液中不仅发现溶菌酶，而且还发现了其他与免疫有关的酶 和因子。 Yoshino 等对未经细菌刺激和经过细菌刺激的 B ． Glabrata 血淋巴中胺肽酶活性进行了研究并指出，在血清 中胺肽酶活性最高，其功能可能与在吞噬前降解血清蛋白中 外来蛋白有关。 Cheng 等对硬壳蛤和美国东部牡蛎血清 和血细胞中 B- 葡萄糖苷酶的研究表明，这种酶可能通过作用 于敏感的入侵细菌，在内部防御中起作用。 Carballal 等用 半定量光密度法测定了贻贝血细胞中与免疫防御功能相关 的酶类，表明该贻贝血细胞含有磷酸酶、脂酶、蛋白酶、葡萄 糖苷酶；这些酶类的活性水平在 11 月和 19 月龄贝中无显著 差异；研究同时表明，溶菌酶活性在血细胞中较高，在血清中 较低， Xue 等采用 APl ZYM 试剂盒对欧洲扁牡蛎和太平 洋牡蛎血淋巴的酶进行测定研究，结果显示在欧洲扁牡蛎可 检测出 15 种酶，而在太平洋牡蛎血淋巴中检测到 16 种酶。 Cronin 等对欧洲扁牡蛎血淋巴中的溶菌酶活性水平进行了 测定研究结果表明，血淋巴中的溶菌酶活性水平个体差异较 大，但在健康贝和患病贝之间无显著差异。 Antonio 等研究 发现在成休太平洋牡蛎血细胞中的溶菌酶活性比血清中的溶 芮酶高五倍，幼贝血细胞中的溶菌酶活性比血清高 98 倍。
丝裂原活化蛋白激酶 (Mitogen — activated protein kinase ， MAPK) 信号通路是近午来发现广泛存在于各种动物细胞中 的一条信号转导途径，在低等无脊椎动物贝类中也存在。 最近研究发现，宿主在清除体内入侵病原体的时候，丝裂原 活化蛋白激酶的激活也发挥着至关重要的作用。研究证 明有纤毛的大肠杆菌和贻贝的血细胞作用后，在血淋巴液的 环境中可诱导 p38 MAPK 的持续磷酸化，如果没有血淋巴液 存在，仅靠血细胞不能引起 P38 MAPK 的磷酸化，但 P38 MAPK 特异性抑制剂 SB302580 可显著降低血淋巴液的杀菌 活性、，这些结果况明 P38 MAPK 在介导血细胞的杀菌过程中 起着重要作用，而且血淋巴液中的其他细胞因子在血细胞杀 菌过程中山起着重要作用。
血细胞对吞噬后病原体的杀伤作用的另一条途径是通 过伴随岙噬作用的呼吸爆发 (Respiratory burst) 来激活位于质 膜 L 的 NADPH 氧化酶，从而产生多种活性氧中间体 (Reactive oxygen intemlediales ， ROls) 来杀伤病原微生物，此过程中产生 的 ROIs 包括超氧化物自由基、过氧化氢、羟基自由基、单线 态氧等。
2 ． 1 ． 2 包囊作用 如果异物比血细胞大得多，例如寄生虫、 坏死组织、外源植人物等，则血细胞对该异物的吞噬动员了 全部的细胞膜表而积，表现为血细胞在异物表面上完全伸 展，扁平化，山若于吞噬细胞共同将异物包裹起来，这称为包 裹作用。最初，血细胞对异物的包裹比较疏松，随着越来越 多的细胞聚集到异物处，与异物直接接触的细胞变扁平，并 充分伸展，形成包裹异物的连续的细胞层。在伸展和扁平化 的过程十微管以及成束的微丝出现在细胞质周边区域，说明 这些结构在细胞伸长的过程中起到了重要的作用。最后，包 裹变得越来越坚固，血细胞通过细胞内和细胞外消化将被包 裹的异物消除。
2 ． 2 异己识别
在吞噬作用中涉及到的一个重要的问题是，血细胞怎样 有效地识别异物，区分自我和非我，这是吞噬作用发挥防御 功能的前提。
2 ． 2 ． 1 调理作用 由于贝类没有类似于高等动物主要组织 相容性复合体 (MHC) 和免疫球蛋白 (1s) 那样的基于可重排分 子的识别系统，贝类对异物的识别主要依赖于一些其他非特 异的识别因子。研究发现，贝类血细胞的趋化、黏附和吞噬 过程都町被某些血清因子促进，这说明贝类血细胞对异物的 识别，类似于高等生物，也依赖于血浆中某些因子的作用，这 些因子统称为调理素。 Smlnia 等证明，将酵母和绵羊红细胞 预先在静水椎实螺 (Lymnaea stagnalis) 的无细胞血淋巴中进 行温育，可以显著提高其血细胞在体外对酵母和绵羊红细胞 的吞噬。 Renwrantz 和 Mohr 的体内实验从另一个角度说明 了同样的问题：他们将人 A1 和 B 型红细胞预先与盖罩大蜗 牛 (Helix pomatia) 的血清在体外进行温育处理，然后注射人该 动物，发现可以显著提高其对人红细胞的清除速率。他们还 发现，如果在首次注射大剂量未经处理的 A1 型人红细胞后， 经过 12 — 19h 后再次注射同样未经处理的 A1 型人红细胞时， 则清除速度与第一次注射相比极为缓慢，表现出一种抑制效 应，而如果将第二次注射的红细胞预先与该种动物的血清进 行温育，则其清除速度与第一次注射类似。这说明产生抑制 效应的原因是第一次注人大剂量的外源颗粒消耗掉了血浆 中某种对识别起辅助作用的调理因子而不是饱和·厂动物的 吞噬能力，这同时说明调理素对血细胞识别异物有重要的促 进作用。
贝类血淋巴中的内源性凝集素已被证明对于识别和吞 噬外源颗粒具有重要的辅助作用。 Lackie 研究结果证明， 除了部分酶对异物有一定的识别作用外，凝集素在识别异物 方面也起着重要作用。 Olafken 证实有时细菌的感染可以 诱导贝类凝集素的产生并促进对细菌的抑制和破坏： Chintala 等证实寄生虫的感染可引起美洲牡蛎血清凝集素浓度的 改变。 Tunkijjanudij 等从马贻贝的血淋巴中得到一种能与 LPS 特异结合的凝集素，它不同于与唾液酸特异结合的凝集 素，该凝集素经纯化后能对多种海洋细菌表现抗菌活性，而 未经处理的贻贝血淋巴对这些细菌的抗菌作用却不明显。 凝集素是一类糖蛋白，具有糖结合专一性，可与细胞表面的 不同糖组分结合，同时可以与吞噬细胞相结合，像桥梁一样 连接血细胞和异物，起到调理作用。凝集素在贝类中广泛存 在，有的存在于血清中，有的分布于血细胞表面。一些凝集 素可使细菌凝剂便于血细胞对其进行吞噬，一些作为血细胞 和细菌表面的中介分子介导吞噬过程。
Howland 和 Cheng 等发现美国东部牡蛎的血细胞可与 细菌表面的一种不含糖蛋白的蛋白质结合，说明在贝类血液 中还有别的因子参与异己识别过程。另外， Cheng 和 Dougher tyk25j 认为吞噬细胞的脱颗粒作用释放出的酶可以修饰外来 细胞的表面结构，从而使外源细胞被有效识别，因此溶酶体 酶在此也起到了调理素的作用。但并不是所有的识别作用 都依赖于血浆因子的调理作用，如 Renwrantz 等证明盖罩 大蜗牛对酵母的清除并不依赖于血浆成分的调理作用。
2 ． 2 ． 2 血细胞表面受体
无论识别是否依赖调理作用，吞 噬细胞表面特定的识别分子 ( 受体 ) 都是必需的。在需要调 理素的情况下，调理素通过识别并结合于外来物质或损伤组 织的表面，为吞噬细胞表面受体提供了易于识别的标记，受 体识别外来颗粒表面的调理素分子。而在不依赖调理素的 情况下，细胞表面受体直接识别异物，识别的完成最终取决 于吞噬细胞膜上的受体。 目前对贝类吞噬细胞的膜表面特 征还知之甚少，一些工作揭示了吞噬细胞表面存在不同专一 性受体。如 Fryer 等发现双肺螺 (Biomphlaria glabratad) 血 细胞对未被调理的酵母的识别町被 B — 1 ， 3 —葡聚糖封闭，因而 推测双肺螺血细胞具有 B — 1 ， 3 —葡聚糖专一性的表面受体。 Stefano 等的实验证明贻贝血液中血液阿片肽类物质可引 起免疫活性细胞的定向迁移，显著加快血细胞的黏附过程。 由于呐咯酮可大大抑制此黏附过程，表明贻贝体内的阿片肽 类物质也和哺乳动物体内的阿片肽一样，是通过细胞表面的 受体介导而起作用的。 Stefano 进一步研究了阿片神经肽的 生理作用，表明阿片肽通过免疫活性细胞表面一种 S 受体的 介导起作用。 Harris-Young 等证明美国东部牡蛎 (C ． virgIntca) 的血细胞没有其他体液因子的协同作用也能够 杀死创伤弧菌 (V.v ulnificus) 。同样条件下，紫贻贝的血细胞 能够吞噬并杀死霍乱弧菌 (V ． cholerae) 和大肠杆菌 (E ． coil) 。 Wootton 和 Colleagues 研究了紫贻贝 (M ． edulis) 、满月蛤 (Cerastoderma edule) 、 Ensis smtqua 的血细胞和 外源凝集素的结合情况，结果表明紫贻贝血细胞与其他两种 贝的血细胞相比，和凝集素 rHPA(Helx pomatia agglutinin) 及 WGA(Wheatgerm agglutinin) 结合率较高，而和伴刀豆球蛋白 (Concanavalin A) 结合率较低。这些试验说明，在贝类血细胞 中存在和外源物质结合的受体，并且这些受体依据外源物质 的不同有不同的结合率。由于凝集素具有与血细胞结合的 特性，口的已被越来越多地用于对贝类血细胞的表面分子特 征进行研究。单克隆抗体以及多克隆抗体也被用来对贝类 血细胞表面特征进行研究，但主要集中在血细胞的分型。虽 然目前这方面的工作还不多，但单克隆抗体和凝集素的运用 必将大大推动对细胞膜表面结构的了解，并将成为重要的研 究手段。
2 ． 2 ． 3 识别机理 贝类没有像高等动物那样复杂的基于基 因重排分子的识别系统，它怎样识别众多入侵的病原体和异 物呢 ? 研究发现，天然免疫识别分子可以识别一大组或几大 组病原体所共有的，保守的，不同于宿主自身成分的某类分 子的结构模式 ( 称为病原体相关分子模式， PAMP) ，如细菌细 胞壁中的肽聚糖，革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，革兰氏阳 性菌细胞壁的磷壁酸，细菌 DNA 中未甲基化的 CPG 二核苷 酸， RNA 病毒的双链 RNA 等。
与抗体对抗原物质识别不同的是，天然免疫分子识别的 不是高度专一性的空间结构和化学结构 ( 抗原决定簇 ) ，而是 某种结构模式，因而是广谱的。这些对 PAMP 进行识别的免 疫识别分子包括血浆中的调理因子以及血细胞表而的某些 受体，它们的存在保证了贝类可以有效地对异物进行识别进 而清除。对外源无机物颗粒的识别，可能也依赖了类似的机 制，即无机颗粒与宿主细胞在疏水性和携带电荷方面的显著 不同构成了另一种可识别的结构模式，被相关的免疫识别分 子识别。
2 ． 3 呼吸爆发 呼吸爆发虽然伴随着吞噬作用而产生，但由于在这个过 程中可产生大量的活性氧中间体来杀灭和消化病原微生物， 所以在免疫防御中起着重要的作用，在此单独进行论述。 适当的刺激后，吞噬细胞经历呼吸爆发并制造大量的细 胞毒氧化剂，即胞毒活性氧，这一现象最初是在哺乳动物的 嗜中性白细胞和巨噬细胞中观察到的。现已证明呼吸爆发 的第一个反应是氧还原一个电子形成超氧阴离子 (02-) ，是 由吞噬细胞膜上的 NADPH 氧化酶催化的，超氧阴离子 (O2-) 被胞质酶超氧化物歧化酶 (SOD) 催化转换成过氧化氢 (H2O2) 。过氧化氢活性很高，是有毒的 RIOs 之一，与髓过氧 化物酶 (MPO) 及卤素形成了强力杀菌系统的基础。另外还 可产生羟基自由基 [OH] 和单线态氧 (O2) 等毒性 R10s ，这些 RIOs 能够参与细胞介导的杀灭细菌、真菌和原生动物过程。 吞噬细胞还具有解毒作用的酶用来防止自身氧化而被损伤， 这些酶有 SOD ，谷光苷肽过氧化物酶，过氧化氢酶和某些维 生素等，它们都是自由基清除剂。
目前已知，很多贝类的血细胞都有典型的呼吸爆发现 象，同时伴有 ROIs 的产生。最初的实验是测定血细胞吞噬 外源颗粒时氧吸收的增加或 MPO- 卤素 -H202 的系统活 性，但没有成功。 Dikkeboom 等刺激椎实螺血细胞后成功 地测定了 04 的产生；同年， Nakamura 等测定了扇贝血细 胞在静止和刺激状态时产生的 H202 。此后，有关贝类血细胞 产生 RIOs 的文章不断增多，在这些文章中， 02 的测定采用 NBT 或细胞色素 c 还原法， H202 测定采用比色 ( 二氨基联苯 胺或酚红还原 ) 或荧光法。细胞化学发光 (CL) 也用作 ROI 产 生的指示剂， CL 法不能提供特殊 R01 种类的定量信息，要区 别 O2 或 H202 产生的 CL 信号要用适当的酶抑制剂。 目前认 为，吞噬细胞的 CL 反应与呼吸爆发时的杀菌活性有关，这种 方法特别推荐用于贝类。 Anderson 和 Adema 等已经将鲁 米诺 CL 方法用在了测定几种双壳类产生的 ROls ，如太平洋 长牡蛎、美国东部牡蛎、大扇贝 (Pecten maxmus) 、欧洲扁牡蛎。 同样地，刺激腹足类血细胞后用 CL 测定也能显示 ROI 的产 生，如在椎实螺、 Helx aspelis 、 Achtina achtina 。 Pipe 等研究 了紫贻贝血细胞的 NBT 定量还原反应，用探针诺丹明 -123 活 化可证明血细胞产生 02- 。虽然常报道 02- 的产生需要呼吸 爆发氧化酶的活化，但 Pipe 证实紫贻贝血细胞可以在无吞噬 或其他刺激下进行 NBT 还原，同时证实酵母聚糖诱导的血细 胞经酚红氧化产生 H20 ，，但未发现有自发的 H2O2 产生，除有 直接细胞毒性， H202 可能与抗菌 Hod 的产生有关，因为贻贝 血细胞内有 MPO 。 Anderson 等通过 NBT 还原实验结果发 现，在静止状态或吞噬过程中，超氧化物歧化酶都可以部分 神经内分泌系统产生的某些多肽激素具有细胞因子样 作用，可调节免疫应答，有研究证明贻贝体内的神经肽不仅 存在于血液中，也存在于血细胞中，经外源性或内源性阿片 神经肽孵育贻贝的血细胞，均可显著提高血细胞的黏附能力 并可引起定向迁移。 Ottaviani 等在贝类血细胞膜上发现 促肾上腺激素释放因子，并将贝类血细胞用含促肾上腺素释 放因子的血清孵育， 15min 后，可刺激血细胞向血清中释放肾 上腺素，在此反应中，酪氨酰脱氢酶、多巴胺脱氢酶参与了生 物胺在血细胞内的合成过程。这些结果表明无脊椎动物的原 始应激反应与哺乳动物的吞噬细胞中出现的反应是相似的。
关于血细胞在损伤修复和炎症反应中的作用，国内外研 究较少。在形态学上的损伤修复过程主要是血细胞识别并 吞噬损伤的细胞，血细胞发生形态学上的变化，并产生胞外 基质，形成凝血，阻止血液流失。 Suzuki 等通过研究珍珠 贝的伤口修复过程发现，无颗粒细胞是伤口修复的关键细 胞，它分泌的胞外基质影响着上皮细胞的迁移和再生。
3 研究展望 依据形态学和酶化学对贝类的不同血细胞进行分类一 直存在很多争议，利用这些指标分类的血细胞有可能仅仅是 它们发育时期的不同阶段，而且这些指标不能从功能上区分 血细胞的亚组分，所以研究血细胞的表面抗原特征和血细胞 表面受体分子并明确不同血细胞的功能，已成为血细胞分类 的一个新的研究方向。研究贝类血细胞表面受体分子对不 同抗原结合能力以及结合过程中的信号转导机制，能为养殖 贝类产业找到合适的免疫增强剂或免疫刺激剂打下理论基 础。目前在贝类血细胞中发现的受体种类还很少，所以寻找 更多的抗原受体种类，明确这些受体识别抗原的物质基础 ( 如它的高级结构 ) 、认识介导免疫应答的信号转导过程将成 为贝类免疫学新的研究热点，这对理解贝类的系统免疫学和 贝类血细胞系统发育有着重要的意义。如在果蝇中，研究人 员发现 PDGF( 血小板源生长因子 ) 与 VEGF( 血管内皮生长因 子 ) 与对应的位于巨噬细胞细胞膜上 PDGF/VEGF 受体分子 (PVR) 结合时就会促进细胞生长， PVR 蛋白能将外部信号传 递转化成细胞机能上的变化。血细胞表面的受体分子承 担着大量的细胞信号转导功能，同样是无脊椎动物的贝类是 否存在同样的机制，这将会是一个具有挑战性的课题。
总之，由于贝类免疫学起步较晚，有关贝类血细胞免疫 功能的研究还有很多需要解决的问题，但可以肯定的是贝类 血细胞在贝类免疫防御过程中起着重要作用，是贝类免疫学 研究的重要领域。所以这一领域的深入研究不仅将揭示一 些无脊椎动物免疫学的基础理论问题，而且对解决养殖贝类 病害的监测、预报、防治及抗逆品种的培育等问题更有重要 指导意义。