1 株军曹鱼病原弧菌的鉴定及其系统发育树分析

  郭明元，刘广锋，冯 娟

 ( 中国水产科学研究院南海水产研究所，广东广州 510300) 

摘要：从养殖的患病军曹鱼身上分离出 1 株病原菌 JT2 ，革兰氏阴性，短杆状，有极生鞭毛，能运动，菌落半透明。经回归   感染实验，证明该菌为军曹鱼病原菌。进行了常规生理生化实验，并用 API-ID32E 系统鉴定该菌。再经 Biolog-GN 细菌   鉴定系统鉴定，结果 JT2 与鲨鱼弧菌 (Vibrio carchariae) 相似度最高。为了进一步确定该菌的分类学地位，测定了其 16S  rDNA 序列，分析了相关细菌的同源性，构建其系统发育树。结果表明，该菌株与 y ． carchariae 的亲缘关系最近。综合   上述几种方法的鉴定结果，最后鉴定该株菌为鲨鱼弧菌 V ． carchariae 。

[ 中国水产科学， 2006 ， 13(5) ： 823 — 828] 

弧菌是海水养殖环境中正常生态菌群，其中   部分种类也是鱼类的重要致病菌。现在已报道的弧   菌有 70 多种，病原菌主要有创伤弧菌 (Vibrio vul —  nificus) 、鳗弧菌 (V ． anguillarum) 、哈维氏弧   菌 (V ． harveyi) 、副溶血弧菌 (y ． para —  haemolyticus) 、溶藻弧菌 (V ． alginolyticus) 、鲨   鱼弧菌 (V ． carchariae) 和最小弧菌 (V ． mimicus)  等。国内已经报道弧菌引起军曹鱼、鲈鱼、牙   鲆、大黄鱼、石斑鱼等鱼类疾病。

  细菌性疾病研究工作中，病原菌鉴定是非常重   要的。传统方法是通过生理生化测试鉴定细菌，现   在的一些细菌鉴定系统 ( 如 ALPI 、 Biolog 等 ) 能更简   便、快速的进行细菌鉴定。近年来分子生物学方法   鉴定细菌也日趋成熟，通过对某种分子标记 ( 如 16S rDNA) 进行分析，可以快速、微量、准确、简便地   对细菌进行分类鉴定。分子分类鉴定已逐步成为微   生物研究的有力工具。

  本实验对从患病军曹鱼分离的细菌进行了生理   生化测试，分别用 API — ID32E 、 Biolog-GN 常用细菌   鉴定系统进行鉴定，并通过测定其 16SrDNA 序列，   构建了系统发育树，分析了相关细菌的同源性。研   究和分析几种鉴定方法，为今后进一步研究军曹鱼   病害提供资料。鲨鱼弧菌 (V.carchariae) 是海水   中的正常菌群，也是海水鱼的重要病原菌之一，但从   军曹鱼分离是国内首次报道。  

3 讨论   细菌鉴定主要方法有 3 种：传统的测定细菌生   理生化特征方法；通过细菌自动鉴定系统鉴定；运用   分子生物学手段进行鉴定。每种方法都有各自的优   缺点，现在鉴定的通常需要 3 种方法结合使用。  

不同的鉴定系统所利用的生化反应和数据库都   各不相同，因此鉴定细菌的准确性也有差异。有人   测试了六种鉴定系统的准确性 11 引，发现对霍乱弧菌  (Vibrio cholerae) ， APl20E 系统对其鉴定成功率为  50 ％，而 Crystal E/NF 系统为 96 ． 7 ％；另外 APl20E  对河流弧菌 (v ． fluvialis) 的鉴定成功率只有 10 ％。   可见，不同系统对同一细菌鉴定成功率不同，同一系   统对不同细菌的鉴定成功率也不同。在实际鉴定过   程中，各系统的实验条件适合不同细菌的生长，而且   各系统数据库细菌特征资料也有不同，所以细菌的   鉴定结果有差异不可避免。有时还可能因为某个种   的血清型不同，而导致系统鉴定不出来或者鉴定错   误。

  在本实验中，菌株 JT2 经常规细菌学生化测定   后，用 API — ID32E 系统鉴定，结果产生不可接受生   化谱，这可能是因为该鉴定系统数据库中没有该菌   株的资料。用 Biolog 系统鉴定，结果可以接受，可鉴   定 JT2 为鲨鱼弧菌 (V ． carchariae) 。再通过基于  16sDNA 序列构建的系统发育树来看，同样 JT2 与   鲨鱼弧菌 (V ． carchariae) 亲缘关系最近。最终可   以确认 JT2 为鲨鱼弧菌 (Vibrocarchariae) 。

  分子生物学方法已作为工具用于细菌鉴定，作   者分析了弧菌属内细菌的同源性，将细菌按亲缘关   系远近顺序进行排列，从系统发育树方面确定细菌   的分类地位。对于亲缘关系较近的细菌，通过表型   分析很难区分开，鉴定时容易产生错误，用分子方法   鉴定能很好的解决这个问题。将生化特征、系统   鉴定、分子指标结合起来综合分析，从而更准确的鉴   定细菌。