国内养殖鱼类和进境鱼卵中传染性造血器官坏死病毒 (1HNV) 的检测及基因分析

刘 荭 范万红 史秀杰 陈 超   吕建强 何俊强 高隆英 江育林

( 深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，深圳 518001 ；   中山大学生命科学学院，广州 510275)

摘要 用传染性造血器官坏死病病毒 (1HNV) 的反转录聚合酶链及该方法在来自国内养殖场的患病牙鲆   和虹鳟及进口的匙吻鲟鱼卵中检测出 IHNV ，同时对扩增出的 IHNV 的 DNA 片段进行了序列分析。结果表   明，从国内养殖的牙鲆和虹鳟中分离出的 IHNV 与 IHNV 的标准株 R1)1 株在序列上都具有 98 ． 1 ％的同源性，   推导出在氨基酸序列上分别具有 97 ％和 99 ％的同源性。从进口匙吻鲟鱼卵中分离的 IHNV 与 RBq 株在序列   上都具有 92 ． 5 ％的同源性，推导出氨基酸序列有 93 ％的同源性。系统发育树分析结果表明，从国内发病的养殖   虹鳟中分离出的 IHNV 与进口匙吻鲟鱼卵中检测到的 IHNV 在进化—亡关系较为密切。

  传染性造血器官坏死病 (infectious haemato —  poietic necrosis IHN) 是鲑、鳟鱼类的一种严重的传   染性疾病。病原为传染性造血器官坏死病毒 (Infec —  tious haematopoietic necrosis virus ， IHNV) ，属弹   状病毒科的粒弹状病毒属 (NovirhaAdOVirld ． S) ，同属   的水生动物病毒还有牙鲆弹状病毒 (Hiramerhab —  dovlrus ， HRV) 、鳢弹状病毒 (SnakeheadrhabdOvir —  u ，， SRV) 和病毒性出血性败血症病毒 (Viral haem —  orrhagic septicaemia ， VHSV) 。 1HNV 是该属的代   表种， IHNV 的代表株是 WRAC 株 (ATCC 编码为  VR — 1392) 。病毒粒子形态为弹状，直径 80 ～  90nm ，长度为 160 ～ 180 nm ，有囊膜。病毒核酸在   硫酸铯中的浮密度为 1 ． 59g ／ mL 。对热、酸、乙醚不   稳定。过去 IHN 只流行于北美洲和欧洲一些国家，  1968 年， IHNV 随红大麻哈鱼鱼卵从阿拉斯加传人   日本北海道。随着水生动物及其产品进出口贸易   的急剧增加， IHNV 已经传人我国，并在我国局部地   区流行。检测 1HNV 的典型方法是利用合适的   鱼类细胞系分离扩增病毒，再通过抗体中和实验确   认有无病毒 (Office International Des EpizOOties ，  2000) 。这种方法对于滴度较低的病毒感染很灵敏，   但是，检验操作费时费力，通常在病毒感染很严重后   才能出现阳性结果。在过去的十几年中，一些用于   检测感染和非感染状态的 IHNV 的方法主要包括   用核蛋白基因特异性的探针进行原位杂交，免疫组   织化学，在体内进行检测的免疫金标记方法、  ELISA 和 RT — PCR 。在这些方法中， PCR 被   证明是最迅速和最灵敏的方法。

  本研究用 IHNV 的 RT-PCR 和 nested — PCR 检   测方法对国内养殖的牙鲆 (Paralichthys oliovaceus )  和虹鳟及进口的匙吻鲟 (Polyodon spathula) 卵进   行 lHNV 的检测，并对所检出的 IHNV 的 DNA 进   行序列分析，比较了它们与 1HNV 标准株的差异。  2 ． 1 患病牙鲆和虹鳟的症状   2001 年 3 月，在深圳某水产养殖场养殖的牙鲆   出现大量死亡。患病鱼体长 10 ～ 30 cm ，发病水温  (22) ℃， 1 周内累计死亡率达到 30 ％，个别池塘   死亡率高达 100 ％。患病鱼包括吻端、鳍条在内的   体表严重溃烂、出血 ( 图 1 — a 、 b) 。解剖后可见腹腔   内有积水，肝脏、脾脏、肾脏等充血，肠道内有卡他性   炎症，肌肉充血。

  2003 年 9 月，北京某水产养殖场养殖的虹鳟暴   发大规模死亡。患病鱼体表两侧和鳍条基部严重充   血，肛门红肿，腹部有出血点，但无溃疡病灶，鳃盖上   有丝状寄生虫。解剖后可见肝脏、肠道和腹腔内粘   膜严重充血，有卡他炎症。鳔出血 ( 图 1 — c 、 d 、 e 、 f) 。